灵芝子实体和孢子粉三萜含量的测定及体外抗肿瘤活性的评价
时间:2020.08.20    来源:微生物学免疫学进展    作者:谭洪升 李翔 巩伯梁 李刚

灵芝( Ganderma lucidum)为担子菌纲,多孔菌科,灵芝属真菌。现代研究表明,灵芝含有多糖、灵芝三萜、肽聚糖、蜜白质、腺苷、凝集素、生物碱、维生素、微量元素等多种活性物质,其中灵芝三萜是一类具有明显生物活性的成分。药理研究证实,灵芝三萜类化合物具有抑制肿瘤细胞、抗血管生成、降血压、保肝护肝、降胆固醇、抑制血小板聚集、抑制组胺释放、抑制补体激活、抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus.HIV)等生物活性。灵芝孢子粉是灵芝在生长成熟期,从灵芝菌盖中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞,近年来研究表明,灵芝孢子粉的醇提物也具有抗肿瘤等活性。由于灵芝孢子粉外壁为一层极难被人体胃酸消化的几丁质,很难被人体肠胃直接吸收,破壁灵芝孢子粉就成为了市面上重要的灵芝类保健食品。


研究以灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉为材料,参照《中华人民共和国药典》205版(一部)(简称《中国药典》)灵芝三及甾醇的测定方法,对灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中的三萜含量进行了定量测定,同时对其醇提物的体外抗肿瘤活性进行了评价,为把灵芝开发成为辅助治疗症药物或保健食品提供理论依据。


1  材料和方法


1.1  供试品  灵芝子实体为人工种植灵芝,由中山大学李刚副教授提供;破壁灵芝孢子粉为市售保健品。


1.2  细胞  抗肿瘤活性评价所使用的宫颈癌HeLa细胞、结肠癌HCT-116细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞,均由中国海洋大学医药学院提供。


1.3  主要试剂及仪器  齐墩果酸对照品(HPLC测定纯度≥98%)购自合肥博美生物科技有限公司;无水乙醇、乙酸乙酯、高氯酸、香草醛、冰醋酸、油酸、二甲基亚矾( Dimethyl sulfoxide,DMSO)、三氯醋酸、醋酸,均为分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司;磺酰罗丹明B( sulforhodamine B,SRB)三羟甲基氨基甲烷,均购自北京索莱宝科技有限公司。752N紫外-可见分光光度计购自上海仪电科学仪器股份有限公司;RE-52CS-1旋转蒸发仪器购自上海亚荣生化仪厂;LGJ-50FD冷冻干燥机购自北京松源华兴科技发展有限公司;PS-40超声波清洗机购自深圳市深华泰超声洗净设备有限公司;BSA124S电子天平购自北京赛多利断仪器系统有限公司;相差倒置显微镜CK40购自OLYMPUS公司;二氧化碳培养箱MCO175购自SANYO公司;SPECTRA MAX Plus型酶标仪购自美国Molecular Devices公司。


1.4  三萜含量的测定方法  测定方法参照文献[5]


1.4.1  对照品溶液的制备  取齐墩果酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1m含0.1mg的溶液,即得.


1.4.2  香草醛冰酸溶液的制备  精密称取香草5g,加冰醋酸使之溶解并定容至100mL,即得。


1.4.3标准曲线的绘制  精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分别置于10mL具塞试管中,挥干,放冷,精密加入新配制的香草酸冰酸溶液0.2mL.高氯酸0.8mL,摇匀,在70℃水浴中加热15min,立即置于冰浴中冷却5min,取出;精密加入乙酸乙酯4mL,摇匀;以相应试剂为空白,测定A546nm,以A546nm值为纵坐标、齐墩果酸的质量为横坐标,绘制标准曲线。


1.5  方法的验证


1.5.1  供试品溶液的制备  精密称取灵芝子实体样品粉末和破壁灵芝孢子粉样品粉末2g,分别置于具塞锥形瓶中,加无水乙醇50mL,超声处理(140W,42 kHz)1h,过滤,滤液置100mL容量瓶中,用适量无水乙醇,分次洗涤滤器和滤渣,洗液并入同一容量瓶中,加无水乙醇至刻度摇匀。


1.5.2  精密度  精密吸取齐果酸对照品溶液0.5mL,平行5份,按1.4项测定,计算所得结果的相对标准偏差relative standard deviation,RSD)RSD≤2%表明方法的精密度良好。


1.5.3  回收率  采用加样法,精密吸取灵芝子实体供试品溶液0.2mL,精密加入相当于其三萜含量80%、100%、120%的齐墩果酸对照品溶液,各2份,按1.4项测定,计算回收率,回收率在90%110%之间为准确度良好。


1.5.4  稳定性  精密吸取灵芝子实体供试品溶液0.2mL,按1.4.3项方法显色后,每隔10min测定A546nm值,计算所得结的RSD,RSD≤2%表明显色后的吸光值稳定性良好。


1.6  灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉三萜含量的测定  精密量取灵芝子实体供试品溶液0.2mL和破壁灵芝孢子粉供试品溶液0.1mL,分别置于10mL具塞试管中,参照1.4.3项方法,自“挥干”起,同法操作,测定A546nm,从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量,计算供试品的三砧含量17醇提物的制备及体外抗肿瘤活性的评价。


1.7.1  活性测试供试品的制备  上述灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉的醇提液经减压真空浓缩,采用真空冷冻干燥后(灵芝孢子粉的醇提物中含较多的油性成分,冻干后油状,子实体的醇提物冻干后呈粉末状),称重,分别以DMSO为溶剂配制质量浓度为100mg/mL的样液,并以10倍比系列稀释,最终给药质量浓度为100μg/mL和10μg/mL。


1.7.2  体外抗肿瘤活性测试  细胞增抑验采用磺酰罗丹明B蛋白染色法(sulforhodamine B,SRB),具体操作过程如下:取对数生长期的直颈Hela细胞、结肠癌HCT-116细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞,用新鲜培养基配制成(4~7)×105个/mL的细胞悬浮液按每孔90μL接种于96孔板中,于5%CO2、37℃条件下培养24h,每孔加入10μL活性测试供试品溶液,每个供试品设3个平行孔,于5%CO2、37℃条件下培养72h;去除培养基,每孔细胞中加入80%三氯醋酸100μL,置于4℃条件下固定1h,用水冲洗5次并空气干燥,每孔加人0.4%SRB的醋酸溶液100μL并在室温避光静置10~5min,用1%醋酸水清洗4次,除去结合的游离SRB染料,室温干燥;每孔加入150μL Tris缓冲液(1mmol/L,pH=10.5)溶解蛋白结合染料,测定每孔的A515nm值,取3孔的平均A515nm值,计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(imhibition rate,IR)。计算公式:IR=(空白A515nm值-样品A515nm值)/空白A515nm值×100%。其中,采用阿霉素作为阳性对照,DMSO为空白对照。


1.8  油酸对三帖含量测定的影响  取1mL油酸置于100mL容量瓶中,加无水乙醇定容至100mL为1%的油酸溶液,参照1.6.1项测定0.4mL1%油酸、0.4mL齐墩果酸对照品溶液、0.4mL齐墩果酸对照品溶液加0.2mL1%油酸、0.2mL灵芝子实体供试品溶液、0.2mL灵芝子实体供试品溶液加0.2mL1%油酸的A546nm值。


1.9  统计学分析  采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料经正态性检验符合正态分布,以x±s)描述组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。


2  结果


2.1  标准曲线  如图1所示,齐墩果酸质量在20~100μg范围内,线性关系良好,r=0.999。

图1


2.2方法的验证


2.2.1  精密度  5个平行样品的吸光度分别为:0.538、0.519、0.526、0.533、0.536,RSD=1.48%,表明方法的密度度良好。


2.2.2  回收率  结果显示,平均回收率为101.78%,RSD=2.48%,见表1。


2.2.3  稳定性  结果显示,RSD为0.52%,表明在显色后1h内A546nm值稳定性良好,在此时间段内完成吸光值的测定准确可靠的,见表2。


2.3  灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉的三帖含量灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉的三萜含量分别为0.92%和2.95%,见表3。

表1

表2

表3

2.4  醇提物体外抗肿瘤活性  结果显示,当灵芝子实体的醇提物的质量浓度为100μg/mL,其对宫颈Hela和乳腺癌MCF-7-ADM细胞表现出了较强的抑制作用,抑制率分别为94.54%和71.30%,均高于空白组,差异均具有统计学意义(P<0.01),随着质量浓度降至10μg/mL,灵芝子实体的醇提物对宫颈HeLa细胞和乳腺癌MCF-7-ADM的分别下降至11.97%和18.24%,均高于空白组,差异均具有统计学意义(P<0.05),表明存在剂量依赖性;灵芝子实体的醇提物对结肠癌HCT-116细胞仅在给药浓度为100μg/mL时表现出了弱的细胞毒活性,抑制率为20.68%,高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.01)。破壁灵芝孢子粉的醇提物对官颈癌Hela细胞表现一定的抑制作用,在质量浓度为10μg/mL和100μg/mL时抑制率分别为22.98%和35.50%,均高于空白组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。其对另外2种细胞系仅在给药质量浓度为10μg p="""""""""""""""""">0.05),见表4。


在100μg/mL时,破壁灵芝孢子粉的醇提物对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用低于灵芝子实体的醇提物,差异具有统计学意义(P<0.01)。

表4

2.5  油酸对三萜含量测定的影响 结果显示不含三萜化合物的1%油酸溶液的A546nm值较大;在油酸存在的情况下灵芝子实体供试品溶液和齐墩果酸对照品溶液的A546nm值均高于未添加油酸的相应对照,差异均具有统计学意义(P0.01),见表5。

表5

3  讨论


   参照《中国药典》灵芝“三萜和甾醇”测定部分的高氯酸比色法对灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉的三萜进行定量分析,结果显示,灵芝子实体供试品三萜含量以齐墩果酸计为0.92%,符合《中国药典》中不得低于0.50%的要求,破壁灵芝孢子粉供试品的三萜质量分数以齐墩果酸计为2.95%。


应用SRB法评价灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉提物的体外抗肿瘤活性,结果显示,灵芝子实体的醇提物对宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞均表现出较强的抑制作用,但三萜含量实测值较高的破壁灵芝孢子粉的醇提物对本研究筛选出3个细胞系仅表现出了较弱的抑制作用。通过进一步的文献查询发现,灵芝孢子粉中的脂肪油成分对常规的高氯酸显色法有明显干扰,测定结果远高于灵芝孢子粉中的总三萜酸含量。研究采无水乙醇超声提取,过滤获得的破壁灵芝孢子粉提取液明显含有较多的油脂性成分。


为了验证脂肪油类的成分是否会对高氯酸色法测定三萜含量造成干扰,本课题组采用常见的油酸进行了试验。结果显示,不含三萜类化合物的1%油酸溶液采用该显色法测定的吸光值较大,且在有油酸存在的情况下灵芝子实体供试品溶液和齐墩果酸对照品溶液显色后的吸光值大大增加。结合韩丁等报道,不难发现高氯酸显色法测定灵芝三萜含量的方法特异性不强,对于含有较多油脂类成分的灵芝孢子粉,采用该方法直接测定很大程度地高估了其三萜含量。据文献报道,灵芝三萜和多糖是灵芝的主要抗肿瘤成分。研究用无水乙醇作为溶剂提取灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉,所得提取物的成分主要为脂溶性的三萜等化合物,并不包含水溶性的多糖成分。三萜是进行活性测试的醇提物的主要抗肿瘤成分,但三萜实测值较高的壁灵芝孢子粉提物并未表现出更强的抗肿瘤活性。此外,一些研究者通过更为准确的高效液相色谱法(high performance liquid chromrutography HPLC来评估灵芝孢子粉中三萜含量的实验结果也表明,灵芝孢子粉中三萜含量明显低于灵芝子实体中的含量。因此,推测本次取样的破壁芝孢子粉中的三萜含量可能远低于实测的2.95%,这可能是导致本研究破壁灵芝孢子粉醇提物体外抗肿瘤活性不如灵芝子实体醇提物的原因。此外,马林等用HPLC分析不同产地的灵芝子实体,灵芝酸的种类和数量各不相同。研究选取的灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉不但产地不同,而且还属于灵芝的不同部位,其灵芝酸的种类可能存在差异,研究也表明,不同种类的灵芝酸生理活性存在差异,这可能也是造成本研究选取的灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉存在生理活性差异的原因。


综上所述,灵芝子实体的醇提物含有三萜,并对人宫颈癌Hela细胞和人乳腺癌MCF-7-ADM细胞均有较强的体外抑制作用,为灵芝开发成为辅助治疗癌症药物或者保健食品提供依据。目前评估灵芝孢子粉类产品总三萜含量多采用高氯酸显色法,但研究发现,灵芝孢子粉含有较多的脂肪油,直接采用高氯酸显色法测定会高估灵芝孢子粉中的三萜含量,因此可能导致市面上一些对于灵芝孢子粉三萜含量的标识和宣传误导消费者,需要进一步开发更为准确的测定灵芝孢子粉中三萜含量的方法。


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