灵芝萃取物对人类肝癌细胞株Hep3B增殖及细胞周期的影响
时间:2020.08.24    来源:广东医学    作者:温凌 ,黄建伟 ,潘洁 ,肖间开

肝癌是我国最常见的一种恶性肿瘤,病死率仅次于胃癌。现有抗肝癌药物多半毒性大,选择性差,并大部分具有免疫抑制等不良反应,亟需寻找新的抗肿瘤药物,中草药抗癌成分是未来努力的方向之一。在我国,灵芝常用于肝癌的治疗,但通过什么机制起作用目前还不清楚。本研究自2009年4月至20104月以灵芝为对象,希望证明灵芝中存在影响人类肝癌细胞Hep 3B增殖与细胞周期的有效成份的假说。


1  材料与方法


1.1  灵芝萃取物的制备  灵芝3kg(购自广州采芝林中药店)以高速粉碎机磨成粉后,分瓶以3L甲醇萃取300g灵芝粉末的比例,于室温下多次搅拌并放置过夜。隔日以纱布过滤得萃取液。萃取液置于抽气柜中,待甲醇挥发后加入去离子水,配成1mg/mL浓度,过滤除菌备用。


1.2  人类肝癌细胞株Hep 3B细胞培养与保存

1.2.1  培养条件 人类肝癌细胞株Hep 3B细胞(上海富众生物科学有限公司)以1×106个/10mL DMEM(添加10%胎牛血清)细胞密度种植于75cm²培养皿,置于5%CO2,的37℃恒温培养箱中培养。48h之后吸除旧培养液,再加入10mL DMEM继续培养48h。待细胞长满则进行传代。传代方法是吸除旧培养液后以5 mL PBS清洗2次并将PBS吸除,再加入0.5mL胰蛋白酶溶液(0.25%)润湿后即吸除,并置入5% CO2的37℃恒温培养箱中作用3 min,再以2mL DMEM将细胞打散,收于15mL的离心管中,以1000r/min离心5 min,移去上清液,所得细胞加人3mL DMEM打散,取20μL细胞液与等体积的4% 胎盘蓝(Trypan blue)混匀,以细胞计数器计算细胞数目,最后以1x106个/10 mL 细胞密度种植于75 cm²培养瓶。


1.2.2  保存  计算已收下细胞的数目,并将细胞密度调至每1.0mL DMEM(含10% DMSO)5×106个细胞,取1.0mL.细胞液置入已编号的细胞冰冻管(2mL规格)中,将冷冻管置入装有异丙醇的冰冻盒中,放入--70℃冰箱,使温度每分钟下降1℃,6h之后再将冷冻管移至液态氮中保存。


1.3  灵芝萃取物对细胞增殖的影响

1.3.1   MTT比色分析法   Hep 3B细胞(5×103个/100μL DMEM/孔,96孔板)经由灵芝萃取物处理48及72h后除去旧培养液,PBS洗2次(100 μL/well),之后每个well加入100μL DMEM及25μL MTT溶液(MTT solution,5mg MTT溶于1mL PBS中),再置人37℃、5%CO2恒温培养箱中反应,4h后每个well加入100uLMITT溶解液(将20g SDS、50mL DMF溶于50 mL水中),再于5%CO2,37℃恒温培养箱中继续反应14 ~16h,之后以酶标仪测其在波长570nm处吸光值。


1.3.2   细胞密度与MTT吸光值关系标准曲线制备   Hep 3B细胞以1、2、5、10及20×103/100 μL/well的细胞密度种植于96孔板中,并同时在每个well中加入25μL之MTT溶液,置入37℃、5%CO2恒温培养箱中反应,4h后每个孔加人100μL MTT lysis buffer,于5%CO237℃恒温培养箱中继续反应14~16h,之后以酶标仪测其在波长570nm处吸光值,作出细胞密度与MTT吸光值关系之标准曲线。


1.4   灵芝萃取物对细胞增殖及形态的影响  Hep 3B细胞以5×10³个/100μL/孔的细胞密度种植于96孔板中,以DMEM(10%FBS)培养24h之后,更换新的无血清DMEM,并加入灵芝萃取物,使终浓度为0、5、10、20、40或50 μg/mL。经过48及72h之后,以MTT测细胞存活率,并以光学显微镜观察各处理组在处理72 h后之细胞形态。利用流式细胞仪分析细胞周期。Hep 3B细胞以1x106/4mL/培养皿的密度种植于6 cm培养皿中,以DMEM 培养24h后再更换新鲜无血清DMEM继续培养,并同时加入去离子水(对照组)及40 μg/mL之灵芝萃取物(灵芝组),于37℃、5%CO2恒温培养箱培养至各作用时间点。并于该作用时间点下将旧的培养液收取,并以胰蛋白酶收下细胞,以1000r/min,4℃离心5min后,所得沉淀再以PBS清洗2次,并以1000r/min,4℃离心5 min去上清液。所得细胞加入500 μL lysis buffer(0.5% Triton X-100,0.2μg/mL及1% BSA溶于PBS)冰上作用15min后加入3 mL,甲醇于室温下继续作用10min,之后细胞液可贮存于-20℃下3周,或以1000r/min,4℃离心5min,再以PBS清洗2次,前述离心条件下得细胞,并加入200 μL DNA-staining buffer[200mg/mL propidium io-dide(PI),5 Kunitz RNase/mL PBS],避光并于冰上作用30 min,之后加入1mL PBS混匀,利用流式细胞仪每次以10000个细胞为单位进行分析,所得数据以Cell Quest软件分析。


1.5 统计学方法 用SPSS10.0统计软件,进行方差分析(Analysis of variance,ANOVA),并以Duncans test来测试不同处理组间的显著差异效果。


2 结果


2.1  灵芝萃取物对人类肝癌细胞株Hep3B细胞增殖的影响 灵芝萃取物随着处理浓度的增加(5、10、20及40μg/mL),Hep 3B细胞增殖能力受抑制程度也增加,呈现剂量依赖现象,且随着处理时间的增长,细胞存活率下降(表1)。Hep 3B细胞以灵芝萃取物处理48及72h,其抑制细胞存活率达50%的浓度(IC50)分别为9.3μg/mL及5.8 μg/mL。光学显微镜观察显示,经灵芝萃取物处理Hep 3B 48h即可看出细胞外观明显变圆,72h可看到凋亡小体的产生。

 表1

2.2  灵芝萃取物对人类肝癌细胞株Hep 3B细胞周期的影响   经灵芝萃取物40 ug/mL处理后,Hep 3B细胞处于G0/G1期的比例随时间增加而减少,G1期细胞比例增加。显示灵芝萃取物使 Hep 3B细胞之细胞周期停止在G2/M期。见表2。

表2

3  讨论


灵芝是我国传统中药材,含有多种生理活性物质,具有扶正固本、增强人体免疫力等功效。近年来,灵芝抗肿瘤作用的研究成为灵芝研究的重点。张群豪等发现灵芝多糖对人骨肉瘤细胞S180的增殖无直接抑制作用。林志彬也发现将灵芝多糖直接加入到培养液中,对人急性髓性白血病细胞HL60细胞的生长也无直接抑制作用。GAO等指出用一种专利方法提取的灵芝提取物(ganopoly)对人宫颈癌细胞CaSki、人类肝癌细胞株HepG2和人结肠癌细胞HCT116具有明显诱导凋亡作用,但对人类肝癌细胞株Hep 3B细胞影响较小。CHANG等也发现灵芝醇对Hep 3B细胞增殖的影响非常小。


 本研究所采用的Hep 3B细胞为人类肝癌细胞株,具有缺少抗凋亡基因p53Bcl-2,但可表现多药抵抗基因MDR-1等特征,是从事肝癌研究很好的实验对象。肝癌细胞对大部分抗癌药物具有抗药性的主要原因是大部分的肝癌细胞MDR-1基因大量表达,将抗癌药物排出细胞外,所以采用Hep 3B细胞能模拟一般肝癌治疗所面临的抗药性问题。


 本研究利用甲醇提取灵芝有效成分,发现随着灵芝甲醇萃取物处理浓度的增加(5、10、20 及40 μg/mL),Hep 3B细胞增殖能力受抑制,程度有增加之趋势,呈现剂量依赖现象,且随着处理时间的增长,细胞存活率下降。在经灵芝萃取物 40 μg/mL处理后,G1期的细胞比例增加,表明灵芝萃取物使 Hep 3B细胞之细胞周期停止在G./M期。由以上结果推测,灵芝甲醇萃取物存在影响Hep 3B细胞增殖与细胞周期的活性物质。这与CHEN等发表的研究结果是一致的。


 本研究结果证实了灵芝中存在影响人类肝癌细胞Hep 3B增殖与细胞周期的有效成份的假说,有望为研究灵芝抗癌机制研究提供新的研究方向。


参考文献

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[5] CHANG U M,LI C H,LIN L I,et al. Ganoderiol F,a ganoder-ma triepene,induces senescence in hepatoma HepG2 cells[J].Life Sci,2006,79(12):1129-1139.

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