灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子粉对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长和VEGF表达的比较研究
时间:2020.08.30    来源:中药药理与临床    作者:王昕妍,陈国杨,苏洁,吕圭源


灵芝孢子粉是灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss.Ex Fr.)Kaurst.]在生长成熟期从菌褶中弹射出来的极其微小的孢子,具有灵芝的全部遗传活性物质。通过生物酶解法、物理法或者化学法将灵芝孢子粉的几丁质外壳破除,可以得到破壁灵芝孢子粉。现代药理研究表明,两种孢子粉均具有抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗辐射、改善内分泌、抗病毒、抗肝纤维化等作用。


    近年来,灵芝孢子粉在肿瘤治疗领域取得了不错效果。有研究证明,灵芝孢子粉和破壁灵芝孢子对HAC肝癌、MCF-7乳腺癌、Hela宫颈癌等肿瘤细胞具有抑制作用。但是关于两者抗肿瘤效果的比较研究很少,且目前临床上多使用破壁灵芝孢子粉。为了比较二者抗肿瘤效果的差异,为其临床用于治疗肿瘤提供实验依据,我们以灵芝孢子粉和破壁灵芝孢子粉为受试药,Lewis肺癌荷瘤小鼠为动物模型,比较二者对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响,并考察效果较好的孢子粉对肿瘤VEGF表达的影响。

 

1 材料与方法


1.1  试验药物  灵芝孢子粉为褐色粉末,由杭州溢宝生物科技有限公司提供(批号:20151109);破壁灵芝孢子粉为深棕色粉末,由杭州澄宝生物科技有限公司提供(批号:20160414),破壁率为99%,4℃密封保存。灵芝孢子粉和破壁灵芝孢子用0.5%CMC-Na溶液配制成相应浓度,4℃保存。环磷酰胺注射粉针剂,百特医疗用品有限公司生产(批号:5BO48A)。


1.2   动物  SPF级C57BL/6小鼠,雌雄各半,体重18~20g,由上海灵畅生物科技有限公司提供,许可证号SCXK(沪)2013-0018。动物饲养环境:温度20~26℃,相对湿度40~70%,光照12小时/天,实验过程中小鼠自由饮食饮水。Lewis肺癌瘤株由中科院上海细胞库提供。

 

1.3  试剂   DMEM高糖培养基(批号:2016080401,吉诺生物医药技术有限公司),Tunel细胞凋亡试剂盒(批号:C328FDO271,生工生物工程(上海)股份有限公司),VEGF抗体(批号:H2615,Santa Cruz)。

 

1.4  仪器  Series 8000 CO2细胞培养箱(Thermo Scientific公司),YaBo400包埋机(常州市雅博电子设备有限公司),SE-RIES NO.531游标卡尺(Mitutoyo公司)。

 

1.5   方法   Lewis肺癌细胞以含100ml/L胎牛血清,100U/ml青霉素及100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基,培养于37℃、5%CO2的培养箱中。取对数生长期的Levis细胞,经胰酶消化,PBS洗涤后,离心,去上清,用生理盐水配制成浓度为1x107 /ml的单细胞悬液,每只小鼠左前肢腋下接种0.2ml的细胞悬液。


C57BL/6小鼠腋下接种48h后,随机分为5组,每组10只,分为模型对照组、环磷酰胺组(0.025g/kg)、灵芝孢子粉组(3、2、1g/kg)、破壁灵芝孢子粉组(3、2、lg/kg)。环磷酰胺组每隔一天腹腔注射环磷酰胺,给药组每日灌胃给药一次,模型对照组灌胃给予相同剂量的生理盐水。


1.5.1  小鼠抑瘤效应测定  给药后观察小鼠的一般状况,如日常活动、精神状态、体重变化。从给药第8d开始,每3天用游标卡尺测量一次肿瘤长径(a)和短径(b),计算肿瘤体积(V=a×b2/2)。连续给药18d后,脱颈处死小鼠,取肿瘤、胸腺、脾脏,称重,计算抑瘤率、胸腺指数、脾指数。抑瘤率(%)=(模型对照组平均瘤重给药组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重×100%,胸腺指数=胸腺重(mg)/体重(g),脾指数=脾脏重(mg)/体重(g)。

 

1.5.2  HE染色 末次给药后处死小鼠,迅速剥离瘤块,4%多聚甲醛固定24h,取材、常规脱水、包埋、切片、脱蜡、染色、封片,显微镜观察并采集图像。

 

1.5.3   Tunel法检测细胞凋亡  取肿瘤组织切片,常规脱蜡至水,PBS漂洗,按照Tunel细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。显微镜下观察拍照,细胞核呈深褐色颗粒者为阳性细胞。

 

1.5.4  免疫组化检测肿瘤组织VEGF的表达  取肿瘤组织切片,二甲苯及梯度酒精脱蜡至水,3%H2O2孵育15min,枸橡酸微波抗原修复;一抗1200稀释,4℃孵育12h,PBS漂洗,二抗1200稀释,37℃孵育1h;DAB显色,苏木素复染,脱水,中性树胶封片。免疫组化阳性着色为棕黄色。以棕黄色的强弱程度为观察指标。

 

2 结果


2.1  对荷瘤小鼠一般状况的影响  给药过程中,模型对照组和环磷酰胺组小鼠活动逐渐减少,毛色无光,精神不振,各给药组小鼠仍维持一定的活动量。与模型对照组比较,破壁灵芝孢子粉3g/kg自给药第9d开始增加荷瘤小鼠体重,2g/kg自给药第13d开始增加荷瘤小鼠体重;破壁灵芝孢子粉三个剂量组在给药第17d均能显著增加荷瘤小鼠体重;而灵芝孢子粉对荷瘤小鼠体重无明显影响,见表1。

 

2.2  对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响  与模型对照组比较,破壁灵芝孢子粉3g/kg、2g/kg自给药第11d显著减小小鼠肿瘤体积,1g/kg自给药第14d显著减小小鼠肿瘤体积,直至给药第17d仍有效。灵芝孢子粉2g/kg、1g/kg自给药第14d减小小鼠肿瘤体积,灵芝孢子粉三个剂量在给药第17d有效,见表2。表明破壁灵芝孢子粉、灵芝孢子粉均能明显抑制肿瘤体积的增大,其中破壁灵芝孢子粉组起效较早且作用较稳定。

表1

 表2

表3

2.3  对荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数及抑瘤率的影响  与模型对照组比较,破壁灵芝孢子粉三个剂量和灵芝孢子粉3g/kg、2g/kg 均能不同程度减少瘤重,破壁灵芝孢子粉和灵芝孢子粉各有2个剂量能升高荷瘤小鼠的脾指数,灵芝孢子粉2g/kg能升高荷瘤小鼠的胸腺指数,见表3。表明破壁灵芝孢子粉在抑制肿瘤生长的效果优于灵芝孢子粉,其三个剂量组的抑瘤净分别为45.26%36.39%、30.15%,从绝对数值看,其抑制作用与给药剂量呈相关性。

 

     结合表2、表3,结果表明,灵芝孢子粉与破壁灵芝孢子粉均有抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的作用。其中,破壁灵芝孢子粉在抑制肿瘤生长的效果优于灵芝孢子粉,且起效较早、作用较稳定。为进一步观察破壁灵芝孢子粉的抗肿瘤作用,我们观察了肿瘤组织病理学变化及肿瘤细胞凋亡情况,并探讨了对VEGF表达的影响。

 

2.4  对肿瘤组织病理状态的影响  肿瘤呈圆形或椭圆形生长,鱼肉状,与周围组织界明显。显微镜下观察HE染色的肿瘤组织切片,模型对照组细胞形状不规则、大小不一,核大,深染,核异形性明显;破壁灵芝孢子粉组可见瘤细胞明显分散,排列疏松,癌巢内坏死面积较模型对照组明显增大,部分核固缩,见图1。


图1

 

2.5  对肿瘤细胞凋亡的影响  TUNEL染色结果显示,凋亡细胞明显固缩,核致密,深染为深褐色;未凋亡的细胞核呈蓝绿色。镜下观察,破壁灵芝孢子粉组均能诱导肿瘤组织的细胞调亡,见图2。


图2

 

2.6  对肿瘤组织VEGF表达的影响   显微镜下观察,细胞膜和胞质内棕黄色颗粒即为阳性信号,VEGF蛋白主要分布于肿瘤细胞的细胞浆或细胞膜上。与模型对照组比较,破壁灵芝孢子粉组均能降低肿瘤组织VEGF蛋白的表达,见图3。


图3

 

3 讨论

 

肺癌又称原发性支气管肺癌,属于中医"肺积"、"咳嗽"、"肺痈"、"胸痛"、"略血"等范畴。由于环境污染严重、生活方式不健康,根据第三次全国居民死因调查结果显示,与80年代相比,我国肺癌的病死率上升了465%,已跃居恶性肿瘤死亡率首位四。中医认为,正气内虚、痰湿瘀毒是肺癌的病理基础;扶正祛邪、标本兼治是治疗肺癌的基本原则网。大量研究表明,中医药在肺癌术后改善患者生存质量、降低复发转移率、延长生存期和调节免疫功能等方面均具有一定优势。

 

灵芝在我国有2000多年的用药历史,被视为滋补强壮、扶正固本的珍品。我国最早的药学著作《神农本草经》将灵芝列为上品,认为灵芝宜"心、肝、脾、肺、肾五脏之气",可"温肺化痰",主治"胸中结""咳逆上气"等。多项临床研究证实,灵芝在治疗肿瘤、失眠、慢性支气管炎、哮喘、冠心病、高脂血症等病症方面均有不错疗效。

 

目前,两种灵芝孢子粉抗肺癌的作用研究多从提高机体免疫方面入手。林庶茹等人发现,破壁灵芝孢子粉可以提高Lewis肺癌小鼠淋巴细胞转化率和吞噬细胞吞噬率;刘伟发现,灵芝孢子粉可以提高Levis肺癌小鼠腹腔M吞噬活性和血清IL-2水平;杨巍通等人发现,灵芝孢子粉可以提高Lewis肺癌小鼠CD4+、CD8+数量。关于两种孢子粉抑制Lewis肺癌生长作用的比较研究很少,临床上常使用破壁灵芝孢子粉,但破壁灵芝孢子粉的价格远高于灵芝孢子粉。为了比较灵芝孢子粉和破壁灵芝孢子的抗肿瘤作用,为临床使用破壁灵芝孢子提供药理依据,本实验通过建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,比较二者的抑瘤作用。结果显示,破壁灵芝孢子粉在提高荷瘤小鼠体重、脾指数和抑制肿瘤生长方面的效果均优于灵芝孢子粉,且起效早、作用较稳定。


为了进一步考察破壁灵芝孢子粉抑制肺癌生长的机制,我们考察了其对肿瘤细胞凋亡和VEGF表达的影响。结果显示,破壁灵芝孢子粉可以诱导肿瘤组织的细胞调亡。细胞凋亡是机体为维持内环境的稳定,在多基因严格下自主有序的灭亡过程。体内通过各种途径诱导肿瘤细胞调亡,可以达到控制、治疗肿瘤的目的;此外,本研究还发现破壁灵芝孢子粉可以下调肿瘤组织VEGF的表达。肿瘤生长依赖新生血管的形成,VEGF在正常和病理血管生成中发挥着中枢作用,它促使血管内皮有丝分裂并最终形成新生血管,是刺激肿瘤血管生成最强的细胞因子。在许多实体瘤中,肿瘤的恶性程度与瘤体内血管化程度呈正相关,过量表达 VEGF与多种肿瘤病情及预后相关。

 

综上所述,破壁灵芝孢子粉抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的效果优于灵芝孢子粉,其作用机制可能是诱导肿瘤组织细胞凋亡,下调VEGF的表达。为临床广泛使用破壁灵芝孢子治疗肿瘤提供了一定的实验依据。

 

 

参考文献

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