灵芝孢子粉对肺癌小鼠突变型P53蛋白表达的影响及抑瘤作用
时间:2020.09.03    来源:陕西中医学院学报    作者:赵燕 席孝贤

灵芝孢子粉是中药灵芝破壁后的孢子,具有防辐射、免疫调节等多种生物学活性。临床已用于多种疾病的治疗。本研究旨在通过灵芝孢子粉对荷Lewis肺癌瘤株小鼠瘤组织突变型P53蛋白的影响及抑瘤作用的研究,从基因表达水平初步阐明灵芝孢子粉防治肺癌的作用及机理。

 

1 实验材料与方法

 

1.1  实验动物  昆明种小鼠,雌雄各半,18~20g,购自第四军医大学实验动物中心。Lewis肺癌瘤株,由甘肃省医学科学研究院提供。


1.2  药品与试剂  灵芝孢子粉:陕西大至医药有限公司;RPMI-1640培养液:GIBCO公司;P53单克隆抗体:北京中山生物制品有限公司;S-P免疫组化试剂盒:北京中山生物制品有限公司。

 

1.3  主要仪器  蔡氏生物显微镜:德国制造;DSA -10图像分析仪:荷兰安米德有限公司。

 

1.4  动物分组及处理  昆明种小鼠30只,随机分为3组,每组10只。造模后第1d起模型对照组用0.4mLNS灌胃,灵芝孢子粉大剂量组和灵芝孢子粉小剂量组分别用100%和50%浓度的灵芝孢子粉0.4mL灌胃。各组均灌胃14d。

 

  将荷Lewis肺癌瘤株小鼠(C57BL/6J)处死后,酒精浸泡消毒,无菌操作下剥离瘤体,研磨、网筛后,稀释为1x107/mL的单细胞悬液(保证95%活细胞率),将此悬液接种至各组小鼠右腋皮下,0.2mL/只。14d左右瘤体直径生长至1.5~2.0cm为造模成功。本实验造模成功率为100%。


1.5  抑瘤效应测定  将全部造模小鼠于第十四天摘眼球放血后断颈处死,无菌剥离瘤组织,取出瘤体,电子天平称取瘤体重量,按下公式计算抑瘤率:


抑瘤率=(荷瘤模型组平均瘤重-荷瘤各用药组平均瘤重)/荷瘤模型组平均瘤重×100%

 

1.6   灵芝孢子粉对实验性肺癌小鼠瘤组织突变型PS5蛋白的测定  摘眼球取血处死小鼠,剥取瘤块,常规福尔马林固定,石蜡包埋,采用标记的链白素-生物素辣根过氧化酶复合物法检测突变型P53蛋白,操作参照文献[1],蜡块按常规切成4μm厚的薄片,60℃烤片2h后37℃过夜。脱蜡及逐级水化,微波处理后加封闭液,置湿盒中孵育切片10min,去封闭液,加入第一抗体,4℃孵育过夜,加生物素标记的第二抗体,37℃30min,玻片浸人3%H2O2溶液中5min,以消除内源性过氧化氧酶的活性。加辣根过氧化酶标记的链白素,37℃ 作用30min。用DAB-HO,显色5~10min,苏木素溶液复染,逐级酒精常规脱水。将玻片浸入二甲苯中2次x10min 透明,用中性树胶封片,光镜下观察结果。差别标准:P53蛋白位于细胞核内,阴性染色的主要形式是细胞核均匀一致的深紫色颗粒,阳性染色的主要形式是细胞核呈棕黄色。每个切片观察200个形态完整的肿瘤细胞,计算各组切片的阳性百分率,并做统计学处理。

 

1.7  统计学处理  实验数据用均数±标准差定X±s 表示,采用方差齐性检验,t检验,差异的显著性以P表示



2  结果


2.1 对肺癌小鼠的抑瘤效应 结果见表1

表1


     结果表明,灵芝孢子粉各用药组瘤体重量显著低于模型对照组。


2.2 灵芝孢子粉对肺癌小鼠瘤组织突变型P53蛋白表达阳性细胞率的影响 结果见表2

表2


   结果表明,灵芝抱子粉用约组肺癌小鼠瘤组织突变型P53蛋白表达的阳性细胞数明显少于模型对照组。



3 结论


    以上实验结果表明∶灵芝孢子粉可显著抑制荷Lewis肺癌瘤株小鼠突变型 P53基因的表达,并具有较强抑瘤作用。


4 讨论


      P53是癌基因研究热点之一。P53蛋白是P53基因的表达产物,半衰期较短,免疫组化难于检测。大量的研究表明,野生型P53基因是重要的抑癌基因,其编码的核磷酸蛋白可通过P21蛋白参与细胞周期的调控,阻止细胞从G1期进入S期,对细胞分裂与增殖起负调节作用。P53基因又是人类肿瘤最常见的基因损伤靶位,P53基因的缺失或突变可引起细胞的生长失控。在人类细胞的恶性病变发展过程中常出现P53基因的突变。突变型P53是一种促癌基因,具有癌基因的功能。P53基因突变后,不仅其抑癌功能丧失,而且具有癌基因的特性,其编码产物能提高细胞增殖能力,引起修复细胞损伤的功能消失,使细胞生长失控、恶性增殖且具有抗凋亡作用,导致细胞转化和肿瘤的发生。肺癌中的P53基因突变率居人类各种肿瘤之首。P53突变的肿瘤细胞又过度表达原癌基因Cyclin D1。从而进一步促进肿瘤细胞的增殖。


      灵芝是传统的名贵中药,灵芝孢子是灵芝生长成熟期从其子实体的菌盖弹射出来的细小的孢子,具有灵芝的重要活性物质。现代药理学研究表明,灵芝孢子粉具有抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等多种生物学活性,但抗肺癌的报道甚少,尚未见到灵芝孢子粉显著抑制突变型P53的报道。肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤。且由于临床发现较晚,5年存活率一直很低,一直被认为是临床常见的重大难治疾病之一。本实验首次证实,灵芝孢子粉显著抑制突变型P53基因的表达,并具有较强的抑瘤作用。


参考文献


[1]肖恩华,李锦清,黄洁夫.肝细胞癌化疗栓塞后P53蛋白表达及意义[J].中国医师杂志,2004,6(3):304--306.


[2]亓梅,赵慧,王翠萍.P53与肺癌诊断治疗研究进展[J].临床肺科杂志,2007,12(11):1239.


[3]徐海玲。非小细胞肺癌中P53与PCNA的表达及临床意义[J].医学理论与实践,2010,23(4):380-381,384.


[4]Heriot AG,Marott JB,cooksonS, etal.Reduction in cyto-kine production in colorectal cancer patients association with stage and reversal by resection Br[J].Cancer,2000, 82(5):1009~1012.

 

 

 

 

 

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